DengLab 微生态笔记 2025年01月22日 18:55 北京
英文标题：Investigating eco-evolutionary processes of microbial community assembly in the wild using a model leaf litter system
中文标题：使用落叶模型系统研究野外微生物群落组装的生态-进化过程
第一作者：Kristin M. Barbour
通讯作者：Jennifer B.H. Martiny
作者单位：Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Irvine, Irvine, CA 92697, United States
期刊：The ISME Journal
发表时间：2024年3月
原文链接：https://doi.org/10.1093/ismejo/wrae043
编译：赵博
群落组装是我们经常会谈到的一个生态学术语，它描述了塑造生态群落中生物身份和丰度的过程。这些过程是理解生态学基本原理的关键，包括生物地理模式、群落对环境变化的响应以及生物多样性与生态系统功能之间的关系。同时，了解微生物群落的组装也可以促进我们改进或设计它们，从而改善人类和环境健康。选择、扩散、生态漂变和多样化这四个过程影响着生态群落的组装，一些设计巧妙的实验已经对扩散或漂变进行了研究，但研究群落组装过程中的多样化，即进化尤其困难。因此，对于这四个相互作用的过程如何结合在一起塑造生态群落组成的大多数证据都来自观察到的模式、理论模型或实验室研究。对于研究群落组装而言，微生物群落的一个未被充分重视的优势是，塑造它们的生态和进化过程往往同时发生。因此，随着基因组测序技术的进步，我们能够同时追踪多样化微生物组的生态动态，以及其中许多物种的进化过程。
在本文中，作者回顾了十多年来她们在实地研究微生物群落组装方面的合作成果。首先，总结了她们使用的位于南加州的表层土壤落叶模型生态系统的一些优势，比如实验方法易于部署并且可重复，而这已通过多年的反复试验得到证实。然后，文章提供了四个群落组装过程中每一个过程单独影响微生物群落组成的证据，以及这些过程部分的协同作用。最后，文章讨论了这些结果对生态系统功能的影响，并提出了未来的研究方向。作者希望这些初步的结果可以为其他具有独特优势的系统提供灵感，因为我们需要各种实验系统，来反复检查和操纵生态-进化过程，从而对微生物群落组装及其在全球环境变化中的影响有一个总体了解。
首先是落叶微生物组作为模型系统来研究群落组装的优势。落叶的分解是陆地碳和养分循环的重要组成部分，主要由微生物控制。在分解过程中，微生物一方面通过矿化落叶中的碳化合物释放二氧化碳，另一方面通过对植物生物量的加工和形成微生物死体（necromass）来促成稳定、难降解的土壤有机质的形成。此外，微生物降解过程还会将养分释放到周围的矿质土壤中，从而改变植物和土壤动物的资源可利用性，并调节碳和养分从地表向深层土壤的流动。除了其在生态系统功能中的重要作用，落叶微生物组还具有一些独特的特性，使其成为研究群落组装的理想系统。首先，落叶的分布天然呈斑块状，这使得元群落的概念框架可以轻松应用于该系统。也就是说一个群落可以定义为单片叶子，或通过扩散连接的叶片斑块。其次，落叶层经历的环境变化比其下方的矿质土壤更为显著，比如紫外线和湿度胁迫。因此，落叶微生物组相比深层土壤群落对环境变化和实验处理的响应更为敏感。第三，落叶层易于获取且具有天然的可再生性，且多次采样叶凋落物比挖取土壤芯的破坏性更小，从而允许在同一地点进行纵向采样，而不会破坏矿质土壤结构。最后，叶凋落物中的微生物多样性适中。相比实验室共生群落，落叶层的细菌和真菌群落具有更高的多样性，但其丰富度和均匀性低于矿质土壤或沉积物。因此，借助这种系统在研究环境中复杂群落动态的同时，有望详细了解群落中优势成员的生物学特征。
基于落叶模型系统，Jennifer团队开发和改进了一系列实验方法，使其成为一个实用的田间实验系统。与矿质土壤相比，测量叶凋落物的关键生态指标相对容易。比如使用显微镜和流式细胞仪定量微生物丰度，测量凋落袋随时间的质量损失可以直接评估分解速率，测定潜在的胞外酶活性和叶凋落物的化学组成等。此外，还可以通过在凋落物浸提液培养基上培养，从而分离出许多优势细菌和真菌类群，用于合成群落的构建以及研究这些类群的表型多样性。这里主要介绍一下用来操控微生物群落的方法，就是用到了这个凋落物袋或者叫微生物笼（Microbial “cages”），用不同孔径的膜来选择性地阻止或允许细菌、真菌、土壤动物和更大的动物扩散，但允许水分和养分流动。根据不同的实验目的，可以设置不同的孔径的膜，比如研究扩散对群落组装的影响时膜需要能够阻止微生物扩散到笼内。为了操控落叶微生物群落，首先通过伽马射线或高压灭菌来尽可能地减少原生群落的丰度，然后使用1%质量比的野外群落重新接种落叶，使接种物群落定殖到原始落叶基质上，并将其封闭在微生物笼中。借助这些微生物笼，从而可以实现将均质化的接种群落复制到多个斑块中，并将它们移植到不同的环境中进行实验，比如不同的处理或地点。但需要注意使用这种微生物笼也存在一些潜在的问题，比如尼龙网会阻挡阳光并可能滞留水分，从而导致笼子内外的非生物环境差异。此外，病毒和非常小的细胞仍可能进入笼子中，从而影响对微生物扩散的研究。同样，笼子在野外可能会出现无法检测的损坏问题，从而导致与附近群落的混合。因此，设置对照实验是必要的，例如使用允许扩散或接种当地群落的凋落袋，以解决这些潜在问题。
利用落叶系统的方法优势，他们对落叶微生物群落进行了各种野外和实验室实验。文章总结了这些研究并综合了基于该系统的主要成果。因为涉及到多篇文章，具体的实验设计读者可以自行阅读这些文章，本文只根据文章的主体讲最主要的一些结果。首先是选择作用，在落叶层中，主要关注环境变化的选择如何影响微生物群落的组装。他们的研究主要是在加州尔湾的洛马岭全球变化实验样地开展的，这个实验样地是在2007 年建立的，模拟了该地区两种主要生态系统类型即半干旱草地和沿海鼠尾草灌木丛在干旱和氮添加条件下的响应。正如之前在许多其他实验中观察到的那样，模拟的全球变化选择了这些生态系统中不同的细菌和真菌群落，干旱、氮添加及其相互作用改变了落叶层中的微生物群落组成。
进一步对全球变化相对于影响群落组装的其他因素的重要性进行了讨论，研究结果表明该站点内大量的群落变化可以归因于季节性或年际变化，即可能是由温度、湿度、紫外线和落叶层演替阶段的波动共同驱动的。相比之下，模拟的全球变化对落叶微生物群落组成的影响较小。比如，干旱始终可以解释细菌组成中约 4% 的变异，尽管当考虑与时间和生态系统类型的交互作用时，这种影响的强度会增加到 10%。这种巨大的时间变异“背景”对于研究群落组装过程有几个重要意义。首先，这意味着在没有足够的重复或纵向采样的条件下，由于缺乏统计能力，实验处理的选择作用可能会被忽略。其次，这表明全球变化因素的影响可能会随时间而变化。比如，经常发现干旱和采样时间对落叶群落组成存在交互作用。第三，这种时间上的背景变异本身是取决于具体的研究背景的。比如，时间变异在落叶层中最强，随着土壤深度的增加而减弱。总的来说，这些结果强调了选择作用在群落组装中的情景依赖性。
在研究选择对微生物群落组装的影响时，一个重要的问题是，在不同的生物和非生物条件下，我们是否可以预测群落组装的结果？我们通常用分类单元或其他生物多样性单位如OTU或ASV来衡量群落组成，但选择最终是因为特定分类单元的功能性状来增加或减少其丰度的。因此，一种更具预测性的方式是识别在特定条件下受到选择作用的关键性状。为此，他们的研究专注于一种落叶优势菌，短小杆菌（Curtobacterium）。这种细菌在全球范围内分布广泛且易于培养，其基因组存在着丰富的遗传多样性，可以聚类为不同的谱系及子谱系，也就是我之前提到过的微多样性。然而，传统的分类学方法无法捕捉到这种多样性，该菌的所有分离株在97%的16S序列相似性下只会被划分为两个OTU，或者四个精确序列变体（Exact sequence variants，ESVs)。此外，生理测试表明，该属内的不同谱系可以通过其降解碳源的能力、生物膜形成能力以及在不同温度下的生长能力进行区分。因此，作者假设这些性状与菌株在不同温度和湿度胁迫条件下存活和繁殖的能力相关。然后，结合基因组和生理数据，他们定义了该菌属的生态型（ecotype），即在基因型和表型上高度相似并占据相同生态位的菌株。研究结果表明，这些生态型在沿气候梯度的不同地点的生物地理分布存在差异。在使用微生物笼控制凋落物基质的影响后，发现其性状与气候梯度相关，表明气候条件和凋落物基质共同选择了某一地点的生态型组成。因此，尽管预测选择对微生物群落组成的影响仍然是一个复杂的任务，但它并非不可解释。通过聚焦于一小部分多样性，并结合实验操控，我们能够识别出与气候响应相关的关键性状。
与选择相比，扩散在微生物群落组装中的作用仍不太清楚。生物地理模式提供了间接证据，表明扩散可能影响微生物组成，但仍缺少更直接的证据。因此，需要进行实验来评估微生物扩散在自然系统中的影响。落叶层是一个很有意思的系统，可以用于研究扩散。因为它定期输入新资源并且位于土壤-大气界面。测量扩散对群落影响的第一步是测试移除扩散的影响。在落叶中，使用微生物笼，可以通过改变膜孔径大小来实现这一点。比如，通过比较封闭系统与开放系统中的微生物群落组装，发现扩散持续改变落叶微生物群落的丰富度、均匀度和组成。这里封闭系统用的是0.22 微米孔径膜，开放系统用的是18微米的膜仅排除一些真菌。
虽然这些结果提供了原位证据表明扩散有助于微生物组装，但仍需要了解扩散速率和扩散路径的详细信息，以更深入地了解微生物扩散及其与其他组装过程的相互作用。由于追踪单个微生物的移动是不可能的，所以他们部署了无菌的载玻片作为微生物“陷阱”来量化落在载玻片上的微生物的速率和组成。同样还是在洛马岭全球变化实验样地开展了实验（具体见本公众号之前的推送：ISME | 细菌扩散的途径和速率影响地表土壤微生物组的组成和功能）。结果表明每平方厘米上平均每天有 7900 个细菌细胞迁移到土壤表层，不同的群落通过不同的途径进行扩散，即不同的源群落如空气或土壤和不同的物理载体如雨或风的组合。此外，暴露于不同的扩散途径会改变微生物群落的演替。总之，这些实验表明，扩散不仅影响群落的组装，而且和选择作用一样依赖于具体的情景。例如，在洛马岭的实验样地，从矿质土壤到表面落叶层的扩散似乎很少，但在野火烧掉表面落叶层后，这一扩散途径变得更加重要。此外，在凋落物演替的早期阶段，如野火之后或绿叶开始衰老时，扩散对群落组成的影响是最大的。
下面是漂变。生态漂变是通过物种相对丰度的随机变化促进多样性形成的过程。虽然通常被视为独立的过程，但漂变与选择和扩散密切相关。具体而言，当选择压力较弱且扩散率较低时，生态漂变对群落组装的影响预计会增强。因此，在生态群落中分离漂变与其他组装过程的影响非常具有挑战性。Jennifer团队首先通过理论模型研究了生态漂变在落叶微生物群落中的作用。酶性状分解模型（DEMENT）用于模拟能够产生胞外酶并分解腐烂凋落物的微生物群落，他们通过量化出生、死亡和扩散过程中的随机差异对模拟群落组成的影响来评估漂变的作用。结果显示，较低的扩散率导致更高的随机性，即更高的群落组成变异。然而，在选择压力较高的情况下，即使扩散率较高，漂变仍然发挥了重要作用。
为了从理论转向实践，他们做了样地研究。通过消除其他过程，特别是选择和扩散的影响，来量化生态漂变对落叶群落的影响。还是使用微生物笼，来最小化混杂的环境变量，从而分离出随机变异的影响。具体来说，为了减少生物异质性，她们将均质化的微生物群落接种到装有灭菌落叶的多个微生物笼中。为了减少环境异质性，实验选择在洛马岭样地内面积为1 平方米的一小块区域内进行。为了对前面理论模型的结果进行验证，她们进一步操纵了扩散和选择压力，即在扩散处理中设置开放和封闭两种系统，而在环境处理中设置降水添加和环境降水两种处理，用来测试漂变是否与扩散和选择相互作用。每个实验处理下设置了8个重复的微生物笼，每个微生物笼采集了三个重复样本。接种的微生物笼于2015年1月8日部署，并于2015年6月5日收集，以配合大部分年度降雨和凋落物分解。
利用这一高度控制的野外微生物笼实验，她们发现生态漂变即随机性不仅影响细菌群落的组装，而且对组成变化的贡献是扩散的三倍。他这里是将相同处理中的不同笼子之间的差异定义为随机性导致的变异，也就是红色的这部分，而同一个笼子内的重复样本之间的差异定义为残余变异，即灰色部分。此外，还发现漂变的影响不仅限于分类组成，还影响群落的其他关键方面，包括功能组成和细胞外酶活性。同时还发现，重复测量中检测到的大部分群落变异约75%可归因于方法因素，例如技术误差和袋内的空间异质性。这一结果强调，如果不量化这些残余变异源，生态漂变对微生物群落组装的影响将被高估。
然后，还与之前的模型研究结果进行了对比，结果表明样地研究结果与之前的模型研究结果并不一致，即随机性随着扩散的减少并没有显著增加，但扩散与降水处理的交互作用会影响一些功能组成的随机性，比如胞外酶活性和凋落物有机质。
第四部分是多样化，也是很少被研究的一个过程。尽管细菌可以进化得相当快，但全新的细菌“物种”（即以16S rRNA基因的分化来衡量）在数百万年内不会出现。尽管如此，进化仍可能在微生物群落中以更精细的遗传分辨率发生。但是在微生物组中成百上千的物种中检测这些变异非常困难。因此，微生物在生态时间尺度上的进化能力，在自然生态系统中仍然基本上未被探索。要研究落叶微生物群落快速进化的潜力，首先要考虑是否可以检测到新生突变的出现。同样使用微生物笼进行样地实验，这个实验是前面研究短小杆菌生态型的那篇文章的一部分，不同的是这里是用短小杆菌的单个同源菌株接种了微生物笼。这些笼子使用相同的无菌落叶基质，然后将其部署在温度和降水呈梯度变化的五个站点内，每个站点设置了5个重复。每6个月，从笼子中采集样品并重新分离菌株进行全基因组测序，共采集了3次为期18个月。最终筛选出112个菌株的全基因组，并确定了单核苷酸多态性(SNP)，并结合宏基因组测序进一步验证了这些突变。结果表明，在与营养获取、胁迫响应和胞外多糖产生相关的基因中均发现了SNP。
进化不仅通过新的突变发生，还通过种群内现有遗传变异频率的变化发生。微生物物种或生态型包含通常共存于生态系统中的现有遗传变异，这种“微多样性”也在落叶层短小杆菌中观察到。为了追踪这种更精细的多样性，她们开发了针对groEL基因的属特异性引物。这个基因她们之前也有文章专门来说明可以反映短小杆菌属的微多样性，然后这里是用这个基因的精确序列变体即ESV来代表短小杆菌属的微多样性，结果表明这种微多样性对干旱和落叶层基质的选择作出响应。在这种精细的遗传分辨率水平上的响应反映了等位基因频率的变化，这种现象在宏观生态学中被认为是一种进化过程。
除了突变、等位基因频率变化，另一个重要的进化过程是重组，而这也是在微生物群落中了解最少的一个过程。基因流即遗传变异的交换是界定种群的依据，而种群通常被认为是进化的基本单位。Jennifer团队利用一系列短小杆菌分离株，基于基因流不连续性来界定种群，在一个生态型的一个亚支中发现了至少三个重组种群，而这种重组似乎是由同源重组介导的。对于重组种群的识别方法，读者可阅读本公众号之前的推送：Cell | 基于微生物种群生物学定义的逆向生态学方法（上）Cell | 基于微生物种群生物学定义的逆向生态学方法（下）。此外，对分离株进行长读测序发现这些菌株还通过质粒的水平基因转移来交换基因。总体而言，仅放大单个菌属就已经能够突出快速进化对落叶微生物群落遗传多样性的影响潜力。但尚未评估这一影响的时间尺度，比如快速进化产生的多样性与通过扩散贡献的多样性的相对重要性。
文章的最后一部分对群落组装是否会影响群落功能进行了讨论。基于微生物笼，可以将非生物环境的影响与初始微生物群落对功能的影响区分开来。同样是在洛马岭的实验样地，在干旱和氮添加处理下，使用不同的接种源、落叶基质分别接种了一系列微生物笼，并设置了相应的对照组。结果表明接种干旱群落改变了落叶分解率，也就是使用在干旱条件下组装的落叶群落作为接种源，会降低落叶分解率，而且这种群落组成的影响与干旱的非生物影响一样大。这表明，选择改变了群落的组成，进而导致了功能不同的群落。此外，扩散过程同样影响落叶群落的功能，比如暴露于扩散的群落最初分解落叶的速度是封闭群落的两倍多，而这种影响在叶片分解的后期阶段减弱。然后生态漂变前面提到过，会影响群落功能组成和细胞外酶活性。
总的来说，这篇文章总结了过去十几年对落叶系统的一系列研究，展示了选择、扩散、漂变和多样化四个过程如何促进细菌和真菌群落组装并最终影响群落功能。这些初步结果表明，生态和进化过程同时发生，并影响微生物群落组装。未来的研究需要关注大型和微型动物的影响，它们可能通过捕食等相互作用对微生物群落产生相当大的影响。其次，要关注微生物之间的相互作用对群落组装的影响，包括细菌和真菌之间的协同和拮抗作用，噬菌体与细菌相互作用等。最后，尽管我们才刚刚开始探索当代进化在落叶群落组装中的作用，但很明显生态和进化过程是同时发生的。因此，我们需要关注进化和生态过程的相互作用，以及随之产生的生态进化反馈。因为这是篇综述，所以每部分实验设计本文讲的也不是很详细，但个人觉得实验设计才是这些文章的精髓，就比如对扩散的研究，他们的实验设计就很巧妙，感觉非常有想象力。抛开实验设计，这些研究的结果其实更多的就是提供了这些过程影响群落组装的一些证据，所以更多的是启发我们如何设计合理可行的实验来研究组装过程。读者感兴趣的可以读一下这些文章。
中国科学院生态环境研究中心
环境生物技术重点实验室
邓晔 研究员课题组发布
