原名：Untangling Microbiota Diversity and Assembly Patterns in the World’s Largest Water Diversion Canal
译名：探究世界上规模最大调水工程渠道中微生物的多样性和群落构建机制
第一作者：Lu Zhang
通讯作者：Feng Ju
第一/通讯作者单位：
a. Key Laboratory of Coastal Environment and Resources of Zhejiang Province, School of Engineering, Westlake University, China;
b. Institute of Advanced Technology, Westlake Institute for Advanced Study, China.
期刊：Water Research
发表时间：2021
研究背景
微生物在全球地化循环中发挥着重要作用，了解微生物群落跨时空的动态变化规律是预测和控制自然和工程系统中微生物群落的必要前提。由于工程系统相较自然生态系统的定向设计和可控性，其中的微生物生态越来越受到关注。饮用水系统中的微生物与水的自净化能力密切相关，并会最终影响公共卫生安全。因此，需要全面的微生物组监测来了解工程水系统中微生物群落的特征，鉴别受干扰的微生物群落，理解其中的微生物过程和规律，以促进可持续和科学的系统管理。我国的南水北调工程是世界上规模最大的跨流域调水工程，旨在缓解我国北方的水资源短缺问题，分为东线、中线（The Middle Route Project, MRP）和西线三条线路。中线工程自丹江口水库调水，输水干渠地跨河南、河北、北京和天津4个省、直辖市。跨流域调水渠道中的微生物在控制其中地球化学过程和指示水质方面具有不可替代的作用，但目前我们对这一类系统中的微生物组成知之甚少。尤其对中线工程而言，封闭的渠道、长距离环境梯度和沿线的大量水利工程结构使得环境因素和随机性过程对渠道中微生物的影响程度难以预估。在本研究中，作者追踪了中线工程输水干渠沿线的原核和微型真核生物群落一年四季的时空动态，以回答如下问题：1）微生物群落随水流和季节如何变化？2）在这样的封闭工程系统中，确定性和随机性过程对微生物群落构建的相对贡献如何？3）从水源地迁移进入渠道的细菌和微型真核生物在调水过程中的归趋如何？
研究方法
1、样品采集和水质分析
作者从19个采样点采集了共50个水样（图1），根据中国地表水环境质量标准测定了水温、pH、溶解氧、总氮和氟等理化参数。
图1：在全长1432公里的南水北调中线总干渠沿线19个位点进行4次采样示意图
2、DNA提取和测序
水样用0.22 μm的硝酸纤维滤膜过滤后提取DNA，随后对细菌16S的V3-V4区域以及真核生物18S的V4区域进行扩增子测序，同时进行宏基因组测序。
3、生物信息学分析
利用Qiime2分析流程和DADA2聚类分析，分别获得了6705个细菌和3217个真核生物的ASVs。宏基因组数据经过质控后用SILVA SSU132数据库搜索识别rRNA基因序列，根据数据库中每条匹配参考序列全长序列覆盖度的总和估算在每个宏基因组中检测到的16S rRNA和18S rRNA基因拷贝数，从而结合细菌16S定量PCR获得的16S rRNA基因拷贝数计算出真核生物18S rRNA基因拷贝数。
4、中性模型和零模型分析
作者对16S和18S的ASV表应用Sloan中性模型和基于零模型的标准化随机性比率（NST）分析揭示随机性过程对微生物群落构建的相对贡献。基于Sloan中性模型，根据ASV被观察到的频率高于、符合或低于中性模型预测的95%置信区间，将ASV划分为三组。
5、局部生长因子分析
对10月数据集所有样品中细菌和微型真核生物ASV计算绝对丰度（将依据扩增子测序数据计算出的每个ASV的相对丰度乘以各样品中rRNA基因的总拷贝数）。为了表征微生物从水源地水库进入封闭的调水渠道后的归趋，作者通过比较微生物在各渠段和渠首的绝对丰度，提出了用局部生长因子(Local growth factor, LGF)来描述种群的增长或受到抑制，计算公式如下：
其中AAx,N 是第N段采样点中ASV x的平均绝对丰度，AAx,OctSO2 是渠首ASV x的绝对丰度。三个渠段的平均LGF>0表示这个ASV在干渠中有增长。
结果
1、微生物生物量和多样性随季节变化
无论是在生物量还是α、β多样性方面， 微生物群落都表现出明显的季节性变化（图2）。分别由16S rRNA和18S rRNA基因拷贝数代表的细菌和微型真核生物量在8月最高，10月最低。PERMANOVA分析表明，季节对细菌（F = 22.78）和微型真核生物（F = 25.57）群落组成均有显著影响（P < 0.001）。此外，无论对细菌（R2 = 0.52 vs. 0.14）或微型真核生物（R2 = 0.55 vs. 0.14）群落而言，季节性的影响比干渠沿线的空间影响更大。
图2：总干渠内细菌和微型真核生物群落的季节性变化
2、微生物群落组成和多样性沿干渠发生变化
丹江口水库（S01）水源地和干渠内细菌组成均以Actinobacteria、Proteobacteria、Bacteroidetes、Verrucomicrobia和Cyanobacteria为主。渠首(S02)的细菌群落在结构上与源水最为相似。然而，与源水相比，干渠中Proteobacteria（S02）的相对丰度下降，而Actinobacteria和Bacteroidetes增加（图3）。在干渠内，Cyanobacteria和Bacteroidetes的相对丰度随水流显著降低（图3）。相比之下，Proteobacteria中的Limnohabitans 和Candidatus Methylopumilus的相对丰度沿干渠升高。相比细菌群落，微型真核生物群落结构沿线变化更大（图3）。以Calanoida为主的Metazoa在丹江口水库的相对丰度高达24.0%。这些微生物在进入干渠后相对丰度增加了2.3倍，但在下游（S03至S18）大幅减少。
图3：2018年10月，南水北调中线总干渠沿线微生物群落组成和多样性分布
3、环境因素影响干渠微生物群落多样性和生物量
温度、pH、溶解氧、总氮、氟化物以及空间因子PCNM1、2和4对细菌群落均有显著影响。除PCNM4之外的这些变量也是微型真核生物群落的重要影响因素（图4）。这些具有显著影响的变量进一步被用于方差分解分析（VPA）。结果表明，无论是对细菌群落还是微型真核生物群落，季节性的影响明显强于空间和环境因素的影响。季节和环境因素共同解释了细菌群落差异的29%和微型真核生物的23%，表明它们在群落构建机制中存在很强的相互作用。
图4：冗余分析(RDA)和方差分解分析(VPA)揭示了季节、空间和环境因素对干渠微生物群落的影响
4、微生物群落的生态随机性因对象、空间和季节而异
微生物在干渠中有明显的扩散以及干渠沿线大量的水利工程影响促使作者探究随机性与确定性过程对干渠中细菌和微型真核生物群落相对贡献如何。作者首先采用标准化随机性比率（NST）分析进行定量评估。NST（数值范围为0-1）量化了在群落构建中随机性的相对重要性，NST>0.5表示群落构建更为随机，而NST<0.5表示确定性过程影响更大。细菌在上游段的NST最高，为0.78（图5）；在渠道中段，该值下降至0.46；在靠近末端处，NST下降至0.32。微型真核生物的NST总体在0.5以上，中间段最高，为0.75。Sloan中性模型分析可以评估中性过程（随机扩散和漂变）对观察到的群落的解释程度。中性模型对10月和3月微生物群落的解释度较高，而对5月的解释度最低。为了将群落动态与种群变化联系起来，作者根据中性模型分析将细菌和微型真核生物ASVs分为3组（“高于预测”，“符合预测”和“低于预测”），发现高于预测组占细菌群落丰富度（即ASV数量）的7.8%，占总序列的67.9%，以Actinobacteria和Proteobacteria为主；而中性分布组的丰富度占86.8%，但仅占序列总数的23.9%。微型真核生物群落也呈现类似规律。
图5：标准化随机性比率(NST)和中性模型分析
5、迁移进入干渠的细菌和微型真核生物种群的选择性生长
为了解析迁移微生物在1432公里中线总干渠中的归趋，作者首次提出了局部生长因子(LGF)分析法。利用LGF分析10月份样本数据集，该数据集由1389个细菌和1229个微型真核生物ASV组成。结果表明，相较于细菌，微型真核生物总体存活率更高：67.1%的细菌ASV和82.3%的微型真核生物ASV的LGF为正值，表明在干渠中有增长（图6）。作者还发现，高丰度的微生物具有比较极端（最高或最低）的LGF数值。例如，高丰度的Luteolibacter sp.（ASV106）和Limnohabitans sp.（ASV27）分别在第二、三渠段LGF最高。与之相反，放线菌CL500-29 marine group（ASV138）和Cyanobium PCC-6307（ASV144和ASV250）尤其在渠道末段受到严重抑制。依据一份已发表的病原菌清单，干渠中共有53个ASV与有致病性的细菌属有关联。除大部分（39/53）的LGF介于-3和3之间，三个Acinetobacter ASV的LGF为-6左右，表明它们在干渠沿线大量消减。
图6：运用局部生长因子分析评估干渠中迁移微生物种群的归趋
讨论
1、干渠沿线微生物群落组成和生物量的动态变化
源水中的微生物和微型真核生物在进入干渠后，其分类和组成都有明显变化，这可以归因于水源地与人工渠道的环境差异以及引渠可能带来的影响。沿线水利工程结构对干渠中的微生物群落组成有很大影响，在长期微生物监测中应充分加以考虑。本文首次报道了干渠中的微型真核生物多样性，作者检测到曾被报道在丹江口水库中基于显微观察检出的大量轮虫类，桡足类和原生动物。另有几千种其他微型真核生物，其中有6.7%在纲水平已未能被分类，说明可能包括了许多新物种。作者发现，与源水相比，渠首SAR分支和 Cryptophyceae的相对丰度明显下降，但它们的绝对生物量并没有明显变化；这主要是由Calanoida在渠首群落中绝对丰度的大幅升高所致。表明了仅靠目前普遍使用的基于序列相对丰度分析微生物群落变化的局限性。
2、微生物群落构建受季节与环境因素影响
环境通过选择更适应相应生态位的种群影响群落组成。在本研究中，温度、pH、溶解氧、总氮和氟化物对干渠群落动态均有显著影响。氟化物可通过酶的靶向抑制影响细菌的生长和代谢。氟化物曾被报道在高氟地下水环境中影响微生物群落结构，以及抑制污水处理系统中的功能微生物种群。本研究结果表明，在饮用水系统中氟浓度在0.14-0.22 mg/L的范围内也会影响微生物群落结构。虽然细菌和微型真核生物群落都受到环境变量和空间的显著影响，但季节性变化更加明显。尽管不能排除未测量的环境因素的潜在影响，但剩余未能解释的群落差异很可能与随机性过程有关。
3、随机性过程对微型真核生物群落影响大于细菌
微生物群落构建由四种过程控制：选择（selection）、漂变（drift）、物种形成（speciation）和扩散（dispersal）。对于中线干渠，选择（确定性过程）、漂变（随机过程）和扩散（两者都涉及）都可能对其中的微生物群落产生影响，它们的相对贡献可以被分解，以帮助回答这些过程发生在何时、何地、为什么以及每种过程对群落动态有多大贡献。基于NST和中性模型分析，作者发现细菌和微型真核生物受随机性和确定性过程的相对影响不同，影响也因季节和渠段而异。与随机性过程主导的微型真核生物群落相比，确定性过程对细菌群落构建的相对贡献更大。尽管生态随机性增加了预测微生物群落的难度，但本研究中获得的新知识有助于提高对渠道微生物群落如何受随机性过程影响的理解，以及了解在何种条件下随机性过程的影响更应被考虑。
4、绝对定量揭示微生物群落动态下的种群变化
综合种群和群落动态的系统分析可以为理解微生物如何驱动生态系统过程提供更深入的启示。在中线总干渠中，微生物种群表现出不同的生长特征，反映了它们对干渠环境适应性的差异。作者展示了通过对微生物种群的绝对定量，利用局部生长因子（LGF）来推断干渠中迁移微生物类群的生长。有67.1%的细菌和82.3%的微型真核生物种群能够保持生长（LGF>0），再次表明真核生物对干渠环境有较好的适应能力。Limnohabitans sp.和Cryptophyceae很可能是干渠水中微食物网的重要组成部分。Cyanobium PCC-6307和Acinetobacter spp.在干渠下游段明显被抑制，表明部分影响干渠水质安全的微生物可能逐渐消亡。Acinetobacter spp.在自然界中普遍存在，具有重要的生态学和临床意义，它的减少可能是由于不利的环境条件或生物间相互作用。从而，本研究证实了LGF分析法可作为调水渠道或类似系统中鉴别重要微生物和评估迁移微生物归趋的有力工具。
结论与意义
本研究揭示了大型调水工程渠道中微生物的群落构建机制和种群动态，利用首次提出的局部生长因子法发现了调水过程中部分潜在有害微生物和病原菌的急剧减少（如：Cyanobacteria，Acinetobacter spp.），以及Limnohabitans sp.等可能是干渠中微生物食物网的重要参与者，表明了微生物群落监测在指示生态系统干扰方面的潜力。此外，在跨流域水质监测中，需要考虑由环境综合效应驱动的细菌群落变化和微型真核生物群落构建的随机性。
转载：西湖大学EMBLab 生态环境科学
课题组简介与招聘信息
西湖大学环境微生物组与生物技术实验室（Environmental Microbiome and Biotechnology Laboratory, EMBLab）开展环境工程学与微生物学交叉学科研究，选取环境微生物组为主要研究对象，以群落结构功能解析、构建理论、功能调控为研究主线，发展微生物群落的定量宏基因组、定量宏转录组学、网络分析等方法，解密群落功能的构建原理，建立功能设计与调控方法，致力于通过环境学原理与生物学前沿技术与理论的交叉融合，为生态环境修复与资源化工程研究提供新技术和新视角。
实验室目前招聘科研助理岗位（“环境生物技术”、“微生物学”、“生物信息学”），欢迎大家与我们联系|联系邮箱：xuyisong@westlake.edu.cn
课题组负责人简介 EMBLab
鞠峰，西湖大学研究员、博士生导师，环境微生物组与生物技术实验室（EMBLab: www.ju-emlab.com; 微信公众号ID: envmbio）负责人，浙江省海岸带环境与资源研究重点实验室副主任，中国工程院院刊《Engineering》编委、Cell Press旗下《The Innovation》青年编辑、《Environmental Science & Ecotechnology》青年编委、Frontiers系列《Environmental Science》、《Microbiology》、《Bioengineering and Biotechnology》期刊编委与审稿编辑，曾担任加拿大自然科学与工程理事会（NSERC）国际评审专家，国际微生物生态学会 (ISME) 、国际水协会 (IWA)、中国环境科学学会(CSES)等会员。2015年获香港大学工学博士学位，2015-2018年在瑞士联邦水科学与技术研究所 (EAWAG) 从事微生物生态与抗生素耐药方向博士后研究，2018年至今在西湖大学担任特聘研究员，曾获中国生态学会“水云天微生物生态青年科技创新奖-特等奖”（2018）、香港科学会“青年科学家奖”（2016）、香港大学“杰出研究型研究生奖”（2015）。目前参编中英文专著3本，在The ISME Journal、Environmental Science & Technology、Water Research、Science of the Total Environment等环境生态学与微生物学领域知名期刊发表学术论文50余篇，谷歌学术引用3200余次。
