邵洋. 植物促生细菌提高狼尾草富集土壤镉的微生物学机制研究. 南阳：南阳师范学院硕士论文，2022.
摘 要
随着现代工业的飞速发展，土壤重金属污染问题日益突出，尤其是土壤中镉（Cd）的大量累积，已严重威胁到我国粮食安全。植物-微生物联合修复技术因成本低、效果好且能够弥补纯植物修复效率低的缺陷，增强植物对Cd的富集，已成为重金属污染修复的研究热点。狼尾草作为能源植物具有生物量大、耐性强等特点，在Cd污染土壤修复研究中具有巨大的应用潜力。因此，本研究以Cd污染土壤为研究对象，利用前期分离筛选得到具有促生作用的功能菌株VY-1（Enterobacter sp. VY-1 ON320412），通过盆栽实验探讨接种植物促生细菌对狼尾草生长及Cd吸收的影响；通过16S rRNA高通量测序及宏基因组学测序，分析接种植物促生细菌对狼尾草修复土壤Cd污染过程中根际微生物群落结构、功能及多样性的影响，并基于LC-MS非靶向代谢组学技术分析接种植物促生细菌对狼尾草修复Cd污染过程中根际土壤代谢组的影响，进而揭示植物促生细菌对提高狼尾草富集土壤Cd污染的微生物学机制。主要结果如下：
1. 采用盆栽实验，以实验室前期筛选到的功能菌株肠杆菌VY-1为研究对象，分析接种VY-1菌株对狼尾草的促生作用及Cd吸收的影响，发现在20 mg·kg-1的Cd浓度处理下接种VY-1菌株后狼尾草地上部分及根部干重分别提高了30.44%、33.16%；狼尾草地上部分及根部对Cd的吸收分别提高了35%、24.2%；地上部分、根部的Cd积累量分别增加了50.5%、65.5%，发现根部是狼尾草积累Cd的主要器官。通过土壤理化性质的测定，发现接种VY-1菌株后土壤样品中总氮、全磷、速效钾、有效磷含量均有所增加，且提高了根际土壤pH值；与未接菌组相比接菌后狼尾草根际土壤中有二乙基三胺五乙酸（DTPA）提取态Cd的含量降低了9%。
2. 通过Illumina MiSeq2000测序分析，发现两组根际土壤样品中共检测出细菌38门，119纲，313目，499科，955属。接种VY-1菌株后狼尾草根际土壤细菌群落组成和结构与未接菌相比存在一定差异，未接菌处理组的丰富度和多样性高于接菌处理组。接种VY-1菌株后狼尾草根际土壤细菌中放线菌门（Actinobacteriota）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、绿弯菌门（Chloroflexi）、拟杆菌门（Bacteroidota）的相对丰度增加，这些菌门具有促进植物生长和Cd耐受性。对环境因子相关性分析发现接种VY-1菌株后，根际土壤速效钾、DTPA-Cd显著影响狼尾草根际土壤细菌群落结构组成（P<0.05），其中髌骨细菌门的丰度与AK呈极其显著负相关（P<0.001）；绿弯菌门的丰度与DTPA-Cd呈显著负相关（P<0.05）；变形菌门的丰度与AK呈显著负相关（P<0.05）；厚壁菌门的丰度与DTPA-Cd呈显著正相关（P<0.05）。
3. 通过宏基因组学分析，发现接种VY-1菌株后提高了细菌的占比。COG注释结果显示两组土壤样品中微生物新陈代谢占绝对优势，与未接菌相比接菌处理组中新陈代谢的占比增加。KEGG注释结果显示两组土壤样品在代谢通路中占比最高，接种VY-1菌株后有更多的基因参与到微生物群落的代谢途径。一些优势KEGG途径在接菌处理组中的相对丰度增加，主要富集于Global and overview maps、碳水化合物代谢、氨基酸代谢等，这些代谢活动可能会提高微生物对Cd的耐受性。在pathway level 3层级中相对丰度最高的为代谢途径，接种VY-1菌株后降低了代谢途径、群体感应等代谢通路的相对丰度；提高了次生代谢物的生物合成、碳代谢等代谢通路的相对丰度。环境因子相关性分析表明微生物群落功能途径的变化主要是由pH、DTPA-Cd的差异引起的，前20个KEGG三级途径中大多数与pH呈显著负相关，其中ABC转运蛋白、氨基糖和核苷酸糖代谢、氨酰tRNA生物合成等的丰度与pH值呈极其显著负相关（P<0.001）。
4. 通过代谢组学分析，发现未接菌与接菌处理组共筛选出27种差异显著的代谢物，其中上调8种，下调19种。接种VY-1菌株后脂类、氨基酸、碳水化合物类等代谢物有所上调。这表明接种VY-1菌株后狼尾草能够通过调节自身代谢产物来抵抗Cd胁迫。KEGG代谢通路分析结果显示，有4种差异代谢物显著（P<0.05）富集到谷氨酰胺和谷氨酸代谢、α-亚麻酸代谢、嘧啶代谢和嘌呤代谢等6条通路当中，且每条通路均有一种代谢物参与。这六个关键代谢途径的参与对Cd胁迫下狼尾草的生长发育和Cd富集效率的提高起到了促进作用。
通过该研究初步掌握接菌处理对Cd胁迫下狼尾草根际土壤细菌的群落组成、多样性、功能的影响因素，为后续植物-促生菌联合修复土壤Cd污染提供了参考依据。
关键词：狼尾草；植物促生细菌；Cd；微生物多样性；宏基因组；代谢组
